结直肠癌（CRC）是全球第二大致死性癌症，从基因组层面而言主要由染色体不稳定性（CIN）或微卫星不稳定性（MSI）引起。MSI指当基因错配修复功能（MMR）受损时，DNA复制过程中的碱基错配大量积累的现象，因而也被称为错配修复缺陷（d-MMR）。驱动两种基因组不稳定性的突变不同：CIN由APC、TP53、KRAS、SMAD4和PIK3CA突变引起；MSI型CRC则与AXIN1、AXIN2、ACVR2A、TGFBR2、BMPR2和BRAF突变紧密相关。

1990年，美国科学院院士Vogelstein和Fearon教授提出Vogelgram模型[1]，描述了CRC腺瘤-癌症序列发展进程同遗传及基因组变化之间的联系（图1）。不过，考虑到CRC整个癌变过程往往历时数十年，其腺瘤-癌症序列难以在体外被完整捕捉，真实可靠的体外模型尤其匮乏。

图1：结直肠肿瘤发生的遗传模型Vogelgram

（来源：参考资料[2]）

2024年11月1日，荷兰乌特勒支大学Hans Clevers教授团队在期刊Nature Cancer发表了题为“Recapitulating the adenoma–carcinoma sequence by selection of four spontaneous oncogenic mutations in mismatch-repair-deficient human colon organoids”的研究论文，首次基于类器官模型在体外跟踪描述了CRC腺瘤-癌序列发展中涉及到的四种关键信号通路突变。研究证明，这些突变中Wnt通路首先发生，p53、BMP通路及EGFR通路紧随其后，相应的突变基因及点位得到阐述。通过生长因子的连续剥夺和添加，本研究成功筛选出自发突变的肿瘤类器官，并在移植小鼠后于体内成功诱导CRC发生，再次强调了该平台作为体外腺瘤-癌序列发展研究模型的可靠性。

（来源：参考资料[3]）

Wnt、EGFR、BMP、p53等通路的激活或抑制已被证明与MMR缺陷型（d-MMR）CRC的腺瘤-癌序列的演进紧密相关。为了在体外解码其背后的基因突变机理，研究人员选择了类器官模型MLH1^KO。此模型通过敲除（KO）MLH1基因，可于体外短期培养中重现d-MMR型CRC突变特征。

本研究中，MLH1^KO在体外长期培养并积累了大量的自发突变。研究人员通过在培养基中独立地去除相关通路的生长因子，如Wnt、R-spondin 1、EGF、Noggin；或添加相关通路的抑制因子，如p53抑制剂Nut3，以筛选发生相应突变的类器官并鉴定突变基因。例如，如果Wnt通路激活的基因突变已经在类器官中自发出现，那么即便剥夺培养基中的Wnt生长因子，该类器官的生长也不会受到影响；反之，未发生该突变的类器官则会死亡。

肿瘤抑制蛋白APC是Wnt/β-cantenin经典信号通路的负调节因子。在CIN型CRC中，当APC突变失活时，β-cantenin积累、稳定性增加，Wnt通路被激活，继而诱导肿瘤的生长和分化。此前实验中，研究团队已确认，通过在CIN型类器官培养基中去除Wnt-3a和Wnt激活剂R-spondin 1（即-WR培养基），可筛选出APC失活的类器官。本实验中，研究人员利用相同的思路，使用-WR培养基筛选MLH1^KO类器官自发积累的突变，最终得到致密且出芽的结构。

图2：-WR培养基筛选

（来源：参考资料[3]）

在同样的抑制或激活干细胞生态位关键通路的培养基中，EGF、BMP和p53通路的筛选均未获取可长期扩增的细胞系，表明在腺瘤-癌序列中，Wnt通路突变必须优先发生。

图3：Wnt通路突变优先发生

（来源：参考资料[3]）

全基因组测序（WGS）分析发现了两个复合杂合AXIN1突变和一个同源AXIN2突变。这与此前报道的AXIN1和AXIN2双等位基因功能丧失突变可以激活Wnt通路并诱导CRC生长和增殖的结论吻合。研究者随后将AXIN突变亚克隆类器官与APC^KO类器官对比，并进行了RT-qPCR分析，确认MLH1^KO类器官可作为体外筛查d-MMR缺陷突变基因的平台，其自发突变可用于模拟体外癌症的演化过程。

在Wnt通路突变的基础上，研究人员展开第二轮筛选。结果发现，去除并抑制EGF的培养基中几乎没有类器官存活。而添加了Nutlins-3的培养基中，只有一个类器官存活并出芽。值得注意的是，添加了BMP通路抑制剂Noggin的培养基有大量类器官存活。

Nutlins-3是蛋白质p53抑制剂。p53也被称作“抑癌蛋白”，当其编码基因TP53突变时，细胞向肿瘤细胞发展。全外显子组测序以及Sanger测序均显示，Nutlins-3挑出的亚克隆类器官中存在TP53的错义突变。

图4：第二次筛选，类器官生长几乎不受Noggin影响，但受Nut3选择

（来源：参考资料[3]）

骨形态发生蛋白BMP通路在大多数散发性CRC中失活。类器官培养时则添加抑制剂Noggin以防止类器官过早分化并促进干细胞自我更新。第二轮筛选中，非Noggin依赖的亚克隆类器官里发现了ACVR2A和BMPR2这两类经典的突变，且在不同的亚克隆中，具体发生突变的点位有所差别。而散发性CRC BMP突变中最为常见的SMAD4突变却未被发现。这与此前文章中报道的BMPR2突变与散发性CRC中SMAD4相互排斥的结论符合。

在Wnt和Nut选择后的双突变株系（MLH1^KO-1-WR-1+Nu-1）内进行第三次突变筛选，EGFR通路依旧无对应突变出现，通过−Noggin培养基获得了筛选结果。与此前未发生p53突变的非Noggin依赖亚克隆类器官相比，该克隆不携带BMPR 2纯合突变，ACVR2A的突变点位也有所区别。这一结果再次肯定了此前“ACVR2A突变是获得Noggin非依赖性的主要原因，BMPR2起到协同作用”的报道。

图5：第三次筛选

（来源：参考资料[3]）

表皮生长因子（EGF）与其受体EGFR结合后，可激活Ras到Raf等一系列通路并影响细胞增殖和细胞周期。在此前的早期选择实验中，均未发现携带EGFR通路突变的亚克隆类器官，研究人员遂在已有的三通路突变的基础之上（MLH1KO-1−WR-1+Nu−N），延长培养时间至300天，在积累更多的突变之后再次进行了选择。

通过向培养基中添加EGFR抑制剂阿法替尼（Afa）和吉非替尼（Gef），最终筛选出RAS突变。RAS基因包含NRAS、HRAS和KRAS，是最常见的致癌基因之一。相较而言，微卫星低度不稳定（MSI-L）内KRAS突变更常见，而NRAS在所有MSI肿瘤中均频繁发生。在本次筛选得到的亚克隆类器官中，发现NRAS杂合体细胞发生已知Ras和Raf通路的致癌突变。

图6：EGFR通路筛选

（来源：参考资料[3]）

至此，研究人员构筑起了具有时序性的四通路突变体类器官。在类器官发育过程中，依次发生AXIN1和AXIN2（激活Wnt通路）、TP53（p53失活）、ACVR2A和BMPR2（BMP通路抑制）以及NRAS（激活Ras和Raf通路）突变，使类器官获得MSI-H状态，独立于一系列生长因子，拥有转化为肿瘤细胞的潜能。在不同克隆中独立观察到相同突变的获得，也证明这些突变的独立出现。

图7：由MLH1^KO-1单个类器官克隆产生的所选突变体克隆的时间尺度遗传树

（来源：参考资料[3]）

研究人员构建无NRAS突变的三通路突变体类器官（KRAS^WT）以及四通路突变体（NRAS^Q61K）等一系列模型，并将其皮下注射到免疫缺陷的小鼠体内。8周的培养后，相较于三通路突变体，四通路突变体克隆具有更高的肿瘤形成率，更大的肿瘤大小，和更高的血管化程度。组织学分析也证实，四通路突变体类器官在异种移植后形成恶性肿瘤。

该结果不仅论证了NRAS突变对于腺瘤-癌序列发展的必要性，也再次表明，自发的四通路突变类器官保留了腺瘤-癌序列发展的能力，是忠实可靠的体外研究模型。

图8：异种移植后8周时异种移植物的肿瘤尺寸

（来源：参考资料[3]）

在此前的实验中，研究团队已经证实MLH1^KO类器官可短期在体外重现d-MMR肿瘤的突变特征。本研究将此结论进一步解析，通过连续剥夺或添加生长因子筛选导致CRC发生的突变。在近1年的长期体外培养实验中，证明CRC发生的第一步突变为AXIN1和AXIN2突变引起的Wnt通路激活，紧随其后的是TP53、BMP通路和EGFR通路的突变。所有结论都证实，MLH1^KO类器官可作为MSI-H肿瘤发生的体外模型。且最终筛选得到的四通路突变体克隆皮下移植后也在小鼠体内致癌。

不过，考虑到肿瘤上皮类器官只能评价纯上皮细胞组分，该系统报道肿瘤微环境和免疫应答的能力有限。且囿于近1年的研究时长和规模限制，实验尚无法兼顾检验突变及突变获得顺序的不同组合。研究人员也提到，鉴于CRC的特殊性方便了四种突变通路的选择，目前的MLH1^KO类器官模型或难以推广到替他肿瘤类型中。

近岸蛋白具备多种经类器官培养验证的细胞因子，让您的类器官培养更可控！